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乳腺癌治疗新靶点——CLDN6与铁死亡的“爱恨纠葛”

研究背景

铁死亡（Ferroptosis）是一种由铁依赖性脂质过氧化驱动的调节性细胞死亡形式，近年来被证实与多种疾病的发生发展密切相关，特别是在肿瘤领域。铁死亡的调控涉及多个因素，其中NRF2是一个关键的转录共激活因子，通过调控其靶基因（如GPX4）来抑制铁死亡。此外，CLDN6（紧密连接蛋白6）作为一种重要的肿瘤抑制因子，在乳腺癌中的表达下调，且与铁死亡的关联尚未明确。本研究旨在深入探讨CLDN6与铁死亡之间的联系，并揭示其在乳腺癌中的潜在调控机制，以期为乳腺癌的预后预测和治疗提供新的视角和靶点。

研究内容

实验结果总结

（一）CLDN6与铁死亡的预后意义

研究团队通过下载GEO中乳腺癌数据，分析CLDN6发现其在正常乳腺组织中高表达，而在乳腺癌组织中低表达。通过加权基因共表达网络分析（WGCNA），发现与CLDN6共表达的基因主要富集在铁死亡、谷胱甘肽代谢和磷酸戊糖途径中。此外，CLDN6的表达与铁死亡评分呈正相关，且低CLDN6表达的患者NRF2表达更高。TCGA和乳腺癌组织微阵列（TMA）中展现出强大的预后预测能力，优于单独的CLDN6表达或铁死亡评分。

（二）CLDN6触发乳腺癌细胞中的铁死亡

细胞功能实验验证（MDA-MB-231和MCF-7），CLDN6的过表达抑制了乳腺癌细胞的活力和克隆形成能力，且这种抑制作用可通过沉默CLDN6恢复。CLDN6过表达的细胞对多种铁死亡诱导剂（如索拉非尼和RSL3）的敏感性增加，且这种敏感性增强可被铁死亡抑制剂Fer-1逆转，而坏死抑制剂NSA或凋亡抑制剂Z-VAD-FMK则无此效果。在超微结构和生化水平上，CLDN6过表达导致线粒体体积减小、膜密度增加，同时活性氧（ROS）和脂质过氧化增加，谷胱甘肽（GSH）水平降低，这些变化可被Fer-1逆转。这些结果表明CLDN6能够诱导乳腺癌细胞发生铁死亡。

（叁）CLDN6通过础碍罢/骋厂碍3β/贵驰狈轴促进NRF2核输出诱导铁死亡

进一步富集分析发现，差异表达基因主要富集在紧密连接、铁死亡、脂肪酸生物合成、谷胱甘肽代谢和NRF2通路中。预测NRF2可能是CLDN6和铁死亡之间的关键所在。实验结果显示，CLDN6不改变NRF2 mRNA水平，但降低了NRF2及其靶基因（包括GPX4和G6PD）的蛋白水平，并减少了NRF2在细胞核中的蛋白水平和定位。这些结果表明CLDN6抑制了NRF2的激活和核定位。研究还发现，CLDN6降低了AKT在Ser473位点的磷酸化水平和骋厂碍3β在Ser9位点的磷酸化水平，同时增加了核内FYN的表达，暗示CLDN6可能通过础碍罢/骋厂碍3β/贵驰狈轴促进NRF2的核输出。

（四）CLDN6通过PBK调节础碍罢/骋厂碍3β/贵驰狈轴

研究发现，CLDN6不显着影响PBK的mRNA水平，但降低了其蛋白表达。泛素-蛋白酶体系统（UPS）介导的降解在PBK蛋白稳定性中起着重要作用。实验显示，CLDN6不改变经蛋白酶体抑制剂MG-132处理后的PBK蛋白水平，但显着缩短了PBK的半衰期，并在蛋白酶体降解被抑制时增加了PBK的泛素化水平，表明CLDN6通过UPS加速了PBK的降解。PBK过表达增加了AKT和骋厂碍3β的磷酸化水平，并降低了核内FYN的水平。此外，PBK增加了总蛋白、核蛋白、NRF2的核定位以及G6PD和GPX4的表达。使用NRF2抑制剂ML385后，发现CLDN6和PBK过表达的细胞中NRF2、G6PD和GPX4的表达降低。进一步结果表明，PBK降低了对多种铁死亡诱导剂、ROS和脂质过氧化物水平的敏感性。这些发现表明CLDN6通过PBK调节础碍罢/骋厂碍3β/贵驰狈轴，诱导NRF2介导的铁死亡。

（五）CLDN6与DLG1/PBK复合体的相互作用需要内质网途径

PBK的亚细胞定位对其功能至关重要，而CLDN6与PBK在细胞膜上共定位。内质网向细胞膜的运输和循环需要VPS35和SNX27的参与。研究发现，CLDN6促进了PBK与VPS35阳性retromer复合体和SNX27的共定位，表明CLDN6通过促进retromer复合体介导的内质网途径将PBK运输到细胞膜。通过共免疫沉淀实验发现PBK与CLDN6具有结合亲和力。结构分析显示，CLDN6和PBK均含有PBM，而DLG1含有叁个PDZ结构域。通过分子对接发现CLDN6的PBM与DLG1的PDZ结构域稳定结合。实验结果表明，CLDN6不增加DLG1的表达，但能与DLG1结合，并在细胞膜上共定位。这些数据表明CLDN6招募DLG1/PBK复合体到细胞膜。为了阐明CLDN6的PBM在连接DLG1和PBK中的作用，研究团队在乳腺癌细胞中转染了缺乏PBM的CLDN6。结果表明，缺乏PBM的CLDN6不再与DLG1或PBK共定位，且不影响PBK蛋白水平，也无法与DLG1或PBK结合。这强调了CLDN6的PBM在招募DLG1/PBK复合体中的不可或缺性。这些结果为CLDN6通过内质网途径招募PBK并与DLG1/PBK复合体结合提供了证据。

（六）CLDN6在体内诱导乳腺癌铁死亡

为了评估CLDN6对铁死亡的影响，研究团队建立了裸鼠皮下异种移植瘤模型。结果表明，CLDN6过表达组的肿瘤体积和重量均小于对照组，且索拉非尼处理加剧了这些变化。通过透射电子显微镜（TEM）观察到，CLDN6导致线粒体膜密度增加和脂滴增加，以及线粒体嵴减少，这些变化在索拉非尼处理后更为明显。这些结果表明CLDN6在体内诱导铁死亡。异种移植瘤组织的IHC染色和WB检测显示，CLDN6过表达和索拉非尼处理组的NRF2和GPX4表达低于对照组。IF染色显示CLDN6、DLG1和PBK在细胞膜上共定位。这些发现表明CLDN6在体内诱导铁死亡，并抑制NRF2和GPX4的表达。

研究结论

本研究揭示了CLDN6在乳腺癌中铁死亡中的关键作用及其潜在机制。研究发现，CLDN6通过招募DLG1/PBK复合体并调节PBK依赖的础碍罢/骋厂碍3β/贵驰狈轴，增强NRF2的核输出，从而触发NRF2介导的铁死亡。此外，CLDN6与铁死亡的整合在预测乳腺癌患者预后方面表现出显着的性能，为乳腺癌的预后评估和治疗选择提供了新的生物标志物。研究还表明，CLDN6通过内质网途径将PBK招募至细胞膜，并与DLG1/PBK复合体结合，促进PBK的降解。这些发现不仅为理解CLDN6在乳腺癌中的作用提供了新的视角，还为开发针对铁死亡的治疗策略提供了理论基础。

Qi D, Lu Y, Qu H, Dong Y, Jin Q, Sun M, Quan C. CLDN6 triggers NRF2-mediated ferroptosis through recruiting DLG1/PBK complex in breast cancer. Cell Death Dis. 2025 Feb 21;16(1):122. doi: 10.1038/s41419-025-07448-9. PMID: 39984471; PMCID: PMC11845765.